精子与卵子受精识别的结构基础丨BioArt国科大论坛

BioArt按：6月24日，BioArt推出“国科大论坛”专栏，旨在鼓励中国科学院大学（UCAS）生命学院的优秀本科生接触学术最前沿，激发他们对生命科学某些领域深层次的理解，同时也锻炼他们对科学报道的写作能力。今日BioArt推出第三篇系列文章，这篇文章解读的是近日来自瑞典卡罗林斯卡学院的科学家发表在Cell杂志上题为“Structural Basis of Egg Coat-Sperm Recognition at Fertilization”的研究论文，揭示了精子与卵子受精识别的结构基础。

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撰文丨崔梦洁（中国科学院大学2014级本科生）

摘要

精子与卵子的受精过程一直是发育生物学研究非常感兴趣的话题。精子与卵子表面配体的结合意味着所有有性生殖生物生命的开始，但是受精过程中具体的特异性结合方式一直是未知的。瑞典Karolinska研究所的Luca Jovine课题组发现了无脊椎动物卵子表面蛋白VERL上的重复序列1-3与精子蛋白溶素的作用，首先获得了精子与卵子表面结合时的蛋白结构，并对这一过程中的生物化学反应、晶体结构、突变型对功能的影响进行了研究。这项成果以“Structural Basis of Egg Coat-Sperm Recognition at Fertilization”为题6月15日发表在Cell杂志上[1 ]。

背景介绍

受精时精子与卵子的第一次结合由卵子表面介导，卵子表面这种特别的细胞外基质在哺乳动物中称为透明带（ZP），在非哺乳动物中称为卵黄包膜（VE）。通过对经典无脊柱动物模型鲍鱼受精过程的研究，作者确定卵子表面亚基VE的溶素受体VERL（VE receptor for lysin）与精子顶体蛋白溶素是相对应的分子伴侣，负责受精过程中精子的初始识别[2 ]。VERL内有22个重复序列[ 3]，1和2处在强正向选择中，而3-22进化中性[4 ]。作者发现其中的重复序列2能够选择性地与来自相同物种的溶素反应，完成精卵识别过程。结合后的VERL/溶素复合体暴露在高度带正电荷卵子表面下，破坏蛋白表面纤维的组织性并引发他们之间的静电斥力，从而打开精子渗透和融合的通道。

图 1 VR2+与VR2/溶素复合体晶体结构

文章解读

对于哺乳动物的研究已经知道，ZP2亚基是在精卵结合过程中作用的结构[5 ]。在ZP2亚基中3个重复序列折叠成结构ZP-N与精子进行结合。作者在哺乳动物内表达了VR1+，一种包含鲍鱼VERL中重复序列VR1和VR2的结构。他发现虽然只有10%的序列相同，VR1+的结构与小鼠体内ZP-N1的结构却是结构性相同的，于是作者推测非脊椎动物中的VERL可能与脊椎动物的ZP2有着同样的功能，即在受精过程中特异性识别同物种精子。

图 2 鲍鱼VR1+与小鼠ZP2的结构对比

为了进一步确定在受精过程中起作用的结构是VERL上的哪一段重复序列，VR1，VR2还是VR3，作者进行了如下实验。作者在未标记溶素的哺乳动物细胞内共表达了VR1+和VERL的重复序列2和3，条件性pull-down实验表面VR2+与VR3+与溶素发生了结合，VR1+未与溶素结合，这说明起作用的结构是VR2或者VR3。为了确定这一结论，作者使用细菌中表达的溶素（lysinR）精炼了0.99Å的脱水晶体，与VR1+和VR3+进行共洗涤，SEC（Size-exclusion chromatography）的结果显示，溶素只与VR3发生了结合。

图 3 pull-down实验结果

随后作者作者要再次确认VR2和VR3中哪个是与精子顶体蛋白发生反应的结构。通过分析VR3+与溶素结合的蛋白质结构，作者发现鲍鱼的VR3+与溶素的结合是刚性的。而溶素中正选择的23个氨基酸组仅有3个氨基酸组参与了形成VR3+/溶素复合体，其中只有氨基酸组K150能和VR3上的结构E384构成外周离子对。但是通过分析复合体结构可知，在精卵结合中进行特异性识别的溶素末端高变N区域在复合体中仍处于游离状态，并未与VR3结合。这说明VR3虽然能与溶素结合，但是它并不是在正选择中起作用的结构。

为了进一步理解受精过程中的物种特异性，作者试将红色鲍鱼中不同重复序列与来自红色、粉色、黑色鲍鱼的精子溶素进行共表达。VR1+不与任何一种溶素反应，VR3+与红色、粉色鲍鱼溶素都发生了结合，证明VR3与溶素的结合与受精过程的特异性反应无关。并且VR3+能与黑色鲍鱼溶素反应，但是黑色溶素在哺乳动物自身表达时是不分泌的。与此同时，VR2+的平行实验显示，它与红色鲍鱼溶素发生了比与粉色鲍鱼溶素更加高效的结合，并且VR2+不与黑色溶素反应。综上所述，VR2+重复序列是在红鲍鱼受精特异性识别时起作用并形成VERL/溶素复合体时起主要作用的结构。

图 4 VR3与溶素的结合

VR2+表面有17个溶素残基，只有K150残基在粉色鲍鱼和红色鲍鱼的VERL残基部分表达不同。K150与VERL的不变残基Glu（E221）形成离子对，这种相互作用在水介导的氢键作用下被增强，并且溶素末端C环中Y151和E34残基形成的分子内氢键能够稳定K150和E221之间的作用。值得一提的是，粉色鲍鱼溶素中Y151残基发生了突变，粉色溶素中Y151N和K150A的作用会损害C环与VR2的相互作用，而在红色鲍鱼溶素中将正选择的N末端区（溶素末端的高变N末端区是与VR/溶素特异性结合的区域）替换为粉色鲍鱼溶素中的同系物，VR与溶素的相互作用会减弱[6 ]。这就解释了为什么红色鲍鱼VR2+与红色鲍鱼溶素的结合比与粉色鲍鱼溶素的结合更有效率。

图 5 VR2与溶素结合

讨论与总结

早在100年前，就已经有科学家提出精子与卵子的结合过程是一种锁和钥匙机制[7 ]，然而受精过程中具体的分子机制却一直不清楚。Jovine课题组的这项工作首次从原子层面揭示了精子如何与卵子进行识别并且绘制出了结合后复合物的三维立体蛋白质结构，不得不说是对受精过程研究的一大突破性进展。

哺乳动物和软体动物的分化经过了数亿年，生命过程的差异很大。脊椎动物精卵结合过程中的受体ZP2早已被发现，而对于无脊椎动物的表面蛋白受体是否是VERL却存在着争议，因为两种蛋白上仅有很少的重复序列。然而Jovine课题组通过构建蛋白的晶体模型发现，序列差异很大的ZP2和VERL有着类似的三维晶体结构，与ZP2结构性相同的VERL就是无脊椎动物受精过程与溶素发生特异性结合的结构。他们的这一发现在无脊椎动物与脊椎动物受精过程的研究之间搭建了桥梁，对后续关于生物受精过程的研究有着很大的启发意义。

参考文献：

[1 ]Structural Basis of Egg Coat-Sperm Recognition at Fertilization . I Raj , AHH Sadat , E Dioguardi , K Nishimura , L Han, L ,  Villa A ,  de Sanctis D ,Jovine L Cell [01 Jun 2017, 169(7):1315-1326.e17]

[2 ] A protein from abalone sperm dissolves the egg vitelline layer by a nonenzymatic mechanism.Lewis, C.A., Talbot, C.F., and Vacquier, V.D.Dev. Biol. 1982; 92: 227–239

[ 3] B.E. Galindo, G.W. Moy, W.J. Swanson, V.D. Vacquier, Full-length sequence of VERL, the egg vitelline envelope receptor for abalone sperm lysin Gene, 288 (2002), pp. 111–117

[4 ] B.E. Galindo, V.D. Vacquier, W.J. Swanson Positive selection in the egg receptor for abalone sperm lysin Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (2003), pp. 4639–4643

[5 ] W.J. Swanson, V.D. Vacquier The rapid evolution of reproductive proteins Nat. Rev. Genet., 3 (2002), pp. 137–144

[6 ] Interspecies chimeric sperm lysins identify regions mediating species-specific recognition of the abalone egg vitelline envelope.Lyon, J.D. and Vacquier, V.D.Dev. Biol. 1999; 214: 151–159

[7 ] Studies of fertilization. VI. The mechanism of fertilization in arbacia.Lillie, F.R.J. Exp. Zool. 1914; 16: 523–590

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